Мечение ДНК/кДНК

Нерадиоактивное мечение ДНК и РНК

Биотин- и Диоксигенин- меченые нуклеотиды

Флуоресцентные нуклеотиды: мощный набор инструментов для мечения биологических макромолекул

ДНК и кДНК фрагменты разной длины ("зонды") способны формировать нековалентные высокоспецифичные дуплексы с комплементарными нуклеотидными цепями (гибридизация). Когда метка присоединяется к такому гибридизационному зонду, она может эффективно служить для детекции определенной ДНК или РНК последовательности-мишени. Меченые ДНК/кДНК зонды обычно используются, например, для (флюоресцентной) in situ гибридизации ((F)ISH - fluorescence in situ hybridization), количественного анализа экспрессии генов на микрочипах или анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA - Electrophoretic mobility shift assay).

Большинство обычно используемых меток для создания нерадиоактивных ДНК/кДНК зондов - это флюорофоры, гаптены, последние представлены Биотином, Детиобиотином, Дигоксигенином и Динитрофенолом. Флюорофоры напрямую определяются с помощью флюоресцентной спектроскопии, тогда как визуализация гаптенов требует вторичных репортерных молекул (непрямых меток). Более подробная информация содержится в руководстве "Нерадиоактивное мечение ДНК и РНК".

Флюорофоры и гаптены ферментативно встроены в ДНК/кДНК с помощью модифицированных нуклеотидов (см.таблицу), которые включены как заменители для их природных аналогов либо при одношаговой процедуре (введение флуоресцентного или гаптен-модифицированного нуклеотида), либо при двухшаговой процедуре (введение реакционной группы, несущей нуклеотид и последующее флуоресцентное или гаптеновое мечение).

Одноступенчатое ДНК/кДНК мечение		Двухступенчатое ДНК/кДНК мечение
Флюоресцентное мечение Флуоресцентные нуклеотиды ПЦР наборы флуоресцентного мечения Fluorescent Nick Translation Labeling Kits		Клик- метки Клик-функционализированные нуклеотиды
Гаптен- мечение Биотинилированные нуклеотиды Дигоксегинин/DNP(динитрофенол) - модифицированные нуклеотиды ПЦР-набор Биотин- мечения		Амин- мечение Амин- модифицированные нуклеотиды

Стандартные ферментные процедуры обработки нерадиоактивных ДНК/кДНК зондов.

Шаблон	Метод	Меченый зонд	Сайт	Фермент
ДНК	ПЦР	ДНК	случайный	Термостабильная полимерана, например, Taq полимераза
	Ник трансляция (смещение разрыва)			Дезоксирибонуклеаза I (DNAse I) / ДНК-полимераза I
	Элонгация праймера			Фрагмент Кленова 3’-> 5’ экзо-, Taq полимераза
	Мечение 3’ конца		3’ OH	Терминальная Деоксинуклеотидил Трансфераза (TdT)
РНК	Обратная транскрипция	кДНК	случайный	Обратная транскриптаза, например, MMLV