Ферментативная CLICK-функционализация ДНК

Реакционные "CLICK"-группы такие как азиды, алкины или DBCO ферментативно встроены в ДНК/кДНК через соответствующие модифицированные нуклеотиды , включенные вместо их натуральных аналогов (Таблица 1). Для обеспечения оптимальных свойств субстрата, основная структура наших модифицированных нуклеотидов получается из натуральных аналогов с желаемой реакционной группой, присоединенной через оптимизированный линкер в одной из благоприятных нуклеотидных позиций(цитидин/уридин:C-5 положение).

Получившаяся CLICK-функционализированная ДНК может впоследствии быть обработана в Cu(I)-катализируемой (азид-алкин) или свободной от меди (азид-DBCO) клик-реакции, дающей возможность:

• внедрить Биотиновую группу для последующего очищения (Азиды Биотина, Алкины Биотина или DBCO-содержащие биотинилирующие реагенты)
• внедрить флюоресцентную группу для последующей визуализации и микроскопирования (via флюоресцентные Азиды, флюоресцентные Алкины или DBCO-содержащие флюоресцентные красители)
• связать ДНК с комплементарными CLICK-функционализированными биомолекулами, например, белками

ПЦР: Полимеразная цепная реакция с Taq полимеразой (CLK-T09, NU-1705) или полимеразами семейства B Pwo, Deep Vent exo^- и KOD XL (CLK-T05/-T06/-T07);
NT: Ник-трансляция с ДНКазой I / ДНК-полимеразой I;
Элонгация праймера: Удлинение праймера полимеразами семейства B Pwo, Deep Vent exo^- и KOD XL;
3'-концевое мечение: включение Терминальной деоксинуклеотидил Трансферазой (TdT);
RT:: Обратная транскрипция с обратной транскриптазой вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV RT)

1: собственное тестирование

2: внешние данные (см. руководство)

n/a: нет информации

- : неприменимо

		ДНК-мечение				кДНК мечение
Нуклеотид	Cat. No.	ПЦР	NT	Элонгация праймера	3’ концевое мечение	RT
dUTP
5-DBCO-dUTP	CLK-T09	x1	n/a	n/a	n/a	n/a
Азид-PEG4-Аминоаллил-dUTP	NU-1705	x1	n/a	n/a	x2	n/a
5-Этинил-dUTP	CLK-T07	x1,2	n/a	x2	n/a	n/a
C8-Алкин-dUTP	CLK-T05	x1,2	n/a	x2	n/a	n/a
5-TCO-PEG4-dUTP	CLK-035	x1	n/a	n/a	n/a	n/a
5-Винил-dUTP	CLK-068	x1	n/a	n/a	n/a	n/a
dCTP
C8-Алкин-dCTP	CLK-T06	x1,2	n/a	x2	x2	n/a
5-DBCO-PEG4-dCTP	CLK-T06	x1	n/a	n/a	n/a	n/a
5-Азидо-PEG4-dCTP	CLK-T06	x1	n/a	n/a	n/a	n/a
dATP
N6-Азидогексил-dATP	CLK-NU-002	x1	n/a	n/a	n/a	n/a

Кроме того, доступны другие Азид-модифицированные, Алкин-модифицированные или DBCO-модифицированные нуклеотиды

ДНК