5'-Capping

Многие эукариотические и вирусные мРНК модифицированы на их 5' концах присоединением 7-метил-гуанозина или m⁷G, известного как "КЭП". "Capping" структуры мРНК играет существенную роль в различных клеточных поцессах, включающих инициацию трансляции^[1], сплайсинг^[2], внутриклеточный транспорт^[3] и обмен веществ^[4].

Соответственно, успешные последующие применения in vitro транскрибированной мРНК сильно зависят от 5' КЭП структуры. КЭПированная мРНК в целом более эффективно транслируется в in vitro трансляционных системах на основе ростков пшеницы и ретикулоцито^[5], и она менее восприимчива к деградации экзонуклеазой во время процедуры микроинъекции по сравнению с не-КЭПированной мРНК^[6].

Синтез КЭПированной мРНК осуществляется в процессе in vitro транскрипции посредством РНК полимеразы бактериофага (T7, SP6 или T3) , которая ко-трансляционно встраивает аналог КЭП в 5'-конец транскрипта (Рис.1).

Реакция с традиционными КЭП аналогами (GpppG, m⁷GpppG или m^2,2,7GpppG) обычно дает выход смеси мРНК, содержащей КЭП-аналоги как правильно, так и противоположно ориентированные^[7]. Поэтому только около 50% КЭПированной мРНК распознается трансляционным аппаратом. Эффективность трансляции, однако, может быть заметно увеличена использованием "anti-reverse" КЭП аналога (ARCA, m^7,3'-OGpppG)^[8]. Это связано с замещением 3'-OH m⁷ гуаниновой группы 3'-O-метиловой группой, что заставляет ARCA встраиваться в правильном положении и итоговый результат оказываетя в районе 100% транслируемой мРНК.

Рисунок1: КЭП аналоги ферментативно встраиваются в 5'-конец РНК в in vitro транскрипции посредством РНК-полимеразы бактериофага

РНК