Белок - ДНК/РНК взаимодействия (EMSA) Nucleotides by Application / ... in Cell Biology - Protein-DNA/-RNA interaction (EMSA)
|
 |
Различные клеточные процессы регулируются сиквенс-специфичным связыванием белков и нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), например, регуляция экспрессии генов через связывание фактора транскрипции со специфической последовательностью ДНК или координация трансляции через РНК-связывающие белки.
Анализ смещения электромобильности (EMSA - Electromobility shift аssay ) - известная методика для детекции сродства белка к известной ДНК или РНК последователоьности in vitro[1]. Вкратце, меченый РНК или ДНК зонд инкубируют вместе с источником белка ( неочищенный клеточный экстракт или рекомбенантный белок) и затем разделяют в неденатурирующем полиакриламидном гель-электрофорезе. Концевое мечение ДНК или РНК зондов, как правило, предпочтительнее случайного мечения поскольку минимизирует интерференцию со связыванием белка. Белково-нуклеиновые комплексы проявляют более низкую мобильность по сравнению со свободными зондами, таким образом, образование комплекса можно определить по изменению схемы миграции (смещения).
Визуализация белково-нуклеиновых комплексов зависит от типа используемой метки. Традиционное мечение основанно на ферментативном встраивании радиоизотопных меток, однако, некоторые нерадиоактивно меченые нуклеотиды также успешно используются для мечения ESMA зондов (Таблица. 1). Также ферментативно встраиваемые леченые нуклеотиды доступны в секциях Мечение ДНК и Мечение РНК.
Анализ смещения электромобильности (EMSA - Electromobility shift аssay ) - известная методика для детекции сродства белка к известной ДНК или РНК последователоьности in vitro[1]. Вкратце, меченый РНК или ДНК зонд инкубируют вместе с источником белка ( неочищенный клеточный экстракт или рекомбенантный белок) и затем разделяют в неденатурирующем полиакриламидном гель-электрофорезе. Концевое мечение ДНК или РНК зондов, как правило, предпочтительнее случайного мечения поскольку минимизирует интерференцию со связыванием белка. Белково-нуклеиновые комплексы проявляют более низкую мобильность по сравнению со свободными зондами, таким образом, образование комплекса можно определить по изменению схемы миграции (смещения).
Визуализация белково-нуклеиновых комплексов зависит от типа используемой метки. Традиционное мечение основанно на ферментативном встраивании радиоизотопных меток, однако, некоторые нерадиоактивно меченые нуклеотиды также успешно используются для мечения ESMA зондов (Таблица. 1). Также ферментативно встраиваемые леченые нуклеотиды доступны в секциях Мечение ДНК и Мечение РНК.
Таблица 1: Выбор нуклеотидов для нерадиоактивного мечения EMSA зондов.
DIG: дигоксигенин; ATTO680: флуоресцентный краситель (exc.: 680 nm /em.: 700 nm); DY776: флуоресцентный краситель (exc.: 771 nm /em.: 801 nm).
| Синтезируем... | Метод | Сайт мечения | Фермент | Labeled nucleotide | Incorporated nucleotides | Детекция |
| ...ДНК зонд | 3'-концевое мечение | 3'-OH | Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Биотин-11-UTP[2] | 1-3 | Непрямая, через репортерный фермент или стрептавидин-связанный флуорофор |
| DIG-11-ddUTP[3] | 1 | Непрямая, через репортерный фермент или антитела к дигоксигенину с флуорофором | ||||
| 5'-концевое мечение | 5'-OH | T4 Полинуклеотид Киназа (T4 PNK) | ATPγS[4] | 1 | Непрямое через Йодацетамид-модифицированный биотин или флуорофоры | |
| ...РНК зонд | In vitro транскрипция | случайный | T7 РНК полимераза | UTP-ATTO680[5,6] | multiple | Прямое измерение флуоресценции |
| UTP-DY776[6] | multiple | Прямое измерение флуоресценции | ||||
| 5'-концевое мечение | 5'-OH | T4 Полинуклеотид Киназа (T4 PNK) | ATPγS[4] | 1 | Непрямое через Йодацетамид-модифицированный биотин или флуорофоры |
| ||||||||||||
| ||||||||||||
Datasheet
| ||||||||||||
| ||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||
| ||||||||||||
| ||||||||||||
| ||||||||||||
Информация представлена исключительно в ознакомительных целях и ни при каких условиях не является публичной офертой
