Thermofluor Screens

JBS Thermofluor Screens предназначены для определения стабилизирующих белок условий, что имеет решающее значение при очистке, определении характеристик и кристаллизации белка [1].

Обычным Обычным репортером стабильности белков является их температура плавления (Tm), которая может быть легко определена анализом сдвига температур при мониторинге разворачивания белков в температурно-зависимые формы. Чем выше Tm, тем выше термостабильность белка в данной конкретной среде.
При низких температурах белок свернут правильно. При увеличении температуры белок постепенно денатурирует, позволяя присутствующему флуорофору взаимодействовать с открывающимися гидрофобными участками белка. Это приводит к увеличению интенсивности флуоресценции до тех пор, пока белок не развернется. Из полученной сигмовидной кривой плавления может быть получена температура плавления [3].

Стабилизирующая белок среда определяется:
I) pH
II) Ионной силой
III) Добавками.
Общее слабое место состоит в том, что pH, ионная сила и наличие добавок являются взаимозависимыми параметрами. Среда с идентичным pH 7.5 может, к примеру, быть получена при использовании 00 mM TRIS/HCl или 50 mM HEPES/NaOH буфера, в то время как ионная сила (100 mM vs. 50 mM буфер) и добавки (молекулы буфера, Na+ vs. Cl-) создают существенно разные условия с непредсказуемым влиянием на стабильность белка - и потенциально накладываются/маскируют pH-эффект.
Поэтоик JBS FUNDAMENT и JBS SPECIFIC Thermofluor Screen основаны на альтернативном подходе, при котором факторы среды подразделяются на:
1. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ факторы, влияющие на все белковые молекулы.
2. ОСОБЫЕ факторы, влияющие на энергетически важные чувствительные участки белка.

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ факторы - это концентрация протонов (H+) (т.е. pH) вместе с ионной силой (т.е. концентрацией всех электролитов). Они затрагивают множество сайтов по всему белку, таким образом, изменяя его основные внутри- и межмолекулярные взаимодействия такие, как кулоновские, электростатические, гидрофобные взаимодействия, солевые мостики, водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса.
ОСОБЫЕ факторы являются добавками, которые напротив влияют только на один или несколько конкретных, но энергетически важных участков белка (например, сайты активности, каталитические центры, интерфейсы димеризации) и включают, в основном, несколько небольших молекул, взаимодействующих с белком как субстраты или их аналоги, катионы, анионы и пр.

JBS FUNDAMENT и JBS SPECIFIC Thermofluor Screen предназначены для устранения нежелательного наложения одновременного скрининга независимых параметров.


Ссылки на литературу:

• Ericsson et al. (2006) Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357(2):289.
• Reinhard et al. (2013) Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor. Acta Cryst. F 69:209.
• Niesen et al. (2007) The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat. Protoc. 2(9):2212.
• http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do