| |
5-hmC детекция (Де)Метилированной ДНК |
 |
5-Гидрокси-Метиул-Цитозин (5-hmC) - модификация ДНК, которая, наряду с ее аналогом 5-Метил-Цитозином (5-mC) - является важным эпигенетическим маркером. Эта модификация связана с такими важными клеточными функциями, как дифференцирование стволовых клеток и развитие мозга [1]. Однако, специфическая детекция 5-hmC - непростая задача, поскольку для обычного бисульфитного секвенирования нет разницы между сайтами 5-mC и 5-hmC[2].
Song et al.[3] разработали подход для выборочной детекции остатков 5-hmC в геномной ДНК, основанный на использовании UDP-6-азид-глюкозы (UDP-6-N3-Glc) (Рис. 1). T4 Phage β-глюкозил-трансфераза фага Т4 переносит азид-модифицированную глюкозную группу на гидроксильную группу 5-hmC. Затем эта структура детектируется в реакции азид-алкинового присоединения (SPAAC) - click-реакция, ускоряемая напряжением циклооктина, без использования медного катализатора.
- Для дальнейшшей очистки - введение DBCO-содержащих соединений Биотина
- Для визуализации и микроскопирования - введение DBCO-содержащих флуоресцентных красителей [1-3].
Рисунок 1. Процесс детекции 5-hmC.
Шаг 1: Гликозилирование ß-гликозил-трансферазой фага Т4 (T4 ß-GT) с одновременной азид-функционализацией группы 5-hmC используя UDP-6-азид-глюкозу (UDP-6-N3-Glc).
Шаг 2: Мечение Азид(N3)-DBCO-содержащей репортерной молекулой (без использования медного катализатора) (DBCO-содержащими соединениями Биотина или DBCO-содержащими флуоресцентными красителями) с образованием стабильной триазольной группы.
Шаг 3: Детекция, аффинная очистка или секвенирование 5-hmC-содержащей ДНК (модифицированной соответственно [3]).
Источники
[1] Branco et al. (2012) Uncovering the role of 5-hydroxymethylcytosine in the epigenome. Nature Reviews Genetics 13:7.
[2] Huang et al. (2010) The behaviour of 5-hydroxymethycytosine in bisulfite sequencing. PLOS One 5(1):e8888.
[3] Song et al. (2011) Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotech 29(1):68.
[4] Li et al. (2012) Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA. J. Vis. Exp. 68:e4441.
[5] Song et al. (2016) Simultaneous single-molecule epigenetic imaging of DNA methylation and hydroxymethylation. PNAS 113(16):4339.
Информация представлена исключительно в ознакомительных целях и ни при каких условиях не является публичной офертой
