Клик-химия (на основе РНК)/кРНК - CLICK T7 in vitro набор мечения при транскрипции

Нерадиоактивно меченые РНК зонды являются неотъемлемой частью анализа экспрессии генов на микрочипах и экспериментов по in situ гибридизации. Их обычно получают с помощью in vitro транскрипции T7 РНК-полимеразой с использованием флуоресцентных, Биотин- либо Амин-меченых аналогов нуклеотидов (преимущесвтвенно 5-меченого UTP или CTP), которые встраиваются в зонд вместо их натуральных аналогов.

Хотя одноступенчатое мечение флуоресцентными UTP или CTP кажется весьма удобным, он имеет проблемы при внедрении вариантов различных флуорофоров, что является существенным недостатком при анализе экспрессии генов. Это может быть преодолено с помощью двухступенчатых подходов, традиционно выполняемого введением малоразмерного амин-меченого UTP или CTP и последующем мечением NHS-эфиром с различными флуоресцентными красителями. Реакция Амин - NHS-эфир, однако, сильно зависит от pH и эффективна в малом диапазоне pH 8.3 - 8.5 (ниже: модификация не происходит из-за протонированной аминогруппы, выше: гидролиз NHS эфира). Кроме того, этот метод не совместим с основанными на Трис in vitro транскрипционными буферами (нужна строго безаминная среда), требуется замена буфера перед мечением.

Новый 5-Азидо-C₃-UTP обеспечивает прекрасный двухступенчатый подход для in vitro мечения РНК при трансляции, основанный на безмедной клик-реакции (Рис.1). Он доступен как простой нуклеотид или как оптимизированный набор для мечения, и сочетает удобство одношагового мечения флуоресцентными нуклеотидами с преимуществами двухступенчатого метода основанного на Амин-NHS-эфире:

• Пригодно для подготовки нерадиоактивных меченых РНК зондов (проверено до 1400 п.н.)
• Пригодно для 3`-Азид-мечения олигонуклеотидов, содержащих T7 промотор ^[1,2]
• нет вариабельности эффективности включения различных флуоресцентных красителей (Азид-РНК получается в простой реакции, может быть разделена и независимо помечена разными DBCO-содержащими красителями)
• эффективность мечения (2-3 красителя на 100 bp)
• нет необходимости замены буфера (совместимо с основанным на Трис in vitro транскрипционным буфером)
• широкий pH диапазон (pH 7-8.5)

Рис. 1 Рабочий процесс РНК модификации, основанной на 5-Азидо-C₃-UTP-(1-й этап) и последующее мечение DBCO-содержащим маркером (например, флуоресцентным красителем или биотином) в безмедной клик-реакции (2-й этап).

Мечение РНК/кРНК