Каталог > Реактивы > Объекты > РНК > Выделение РНК из биологического материала > Выделение и очистка РНК >
Набор для выделения тотальной РНК Выделение тотальной РНК адсорбцией на силикагелевой мембране



Документы
Datasheet

Подготовительные процедуры: Перед началом разбавьте лизирующий буфер 2-Меркаптоэтанолом и отмывочные буферы этиловым спиртом, как указано на соответствующих бутылях и в таблице ниже.

Дополнительно потребуется (не входит в набор):

• 2-Меркаптоэтанол (2-ME)
• Опционально: хлороформ
• 96-99% этиловый спирт
• 2-Пропанол (Изопропанол)
• 96-99% этиловый спирт
• Пробирки 1,5 мл.

Состав набора:

	PP-210XS (10 реакций)	PP-210S (50 реакций)	PP-210L (250 реакций)
Лизирующий буфер Стабилен 1 месяц при комнатной температуре	5,2 мл (добавьте 52 мкл 2-ME)	26 мл (добавьте 260 мкл 2-ME)	130 мл (добавьте 1.3 мл 2-ME)
Активационный буфер	1,2 мл	6 мл	30 мл
Отмывочный буфер для крови	Добавьте 6.4 мл этанола (итоговый объем 8 мл)	Добавьте 32 мл этанола (итоговый объем 40 мл)	Добавьте 160 мл этанола (итоговый объем 200 мл)
Первичный отмывочный буфер	Добавьте 1.6 мл этанола (итоговый объем 8 мл)	Добавьте 8 мл этанола (итоговый объем 40 мл)	Добавьте 40 мл этанола (итоговый объем 200 мл)
Вторичный отмывочный буфер	Добавьте 6.4 мл этанола (итоговый объем 8 мл)	Добавьте 32 мл этанола (итоговый объем 40 мл)	Добавьте 160 мл этанола (итоговый объем 200 мл)
Элюционный буфер	1 мл	5 мл	25 мл
Спин-колонки
Пробирки 2 мл.

Выделение тотальной РНК в колонках

1. Подготовка пробы и лизирование клеток:
   1. Кровь
      • Поместите 100 мкл некоагулированной крови в микроцентрифужную пробирку
      • Добавьте 500 мкл Лизирующего буфера и перемешайте на вортексе 10 секунд
   2. Свежие образцы животной и растительной ткани
      • Соберите 20-50 мг образца свежей ткани в микроцентрифужную пробирку.
      • Добавьте 300 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME) и гомогенизируйте материал, используя подходящее устройство (пестиком, гомогенизатором и т.д.)
      • Добавьте еще 200 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME) к гомогенизированному образцу и перемешайте на вортексе 15-30 секунд (Объем образца не должен превышать 10% от объема лизирующего буфера).
      • Центрифугируйте при 10 000 g в течение 10 минут.
      • Необязательный шаг для случая, когда в супернатанте еще остаются нерастворенные остатки:
        Добавьте 500 мкл хлороформа (не включен в набор), перемешайте на вортексе 15-30 секунд, после чего центрифугируйте при 10 000 g 10 минут.
      • Перенесите супернатант (если вы использовали хлороформ - верхнюю водную фазу) в микроцентрифужную пробирку
   3. Клетки из носовых и горловых мазков
      • Добавьте 300 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME) в микроцентрифужную пробирку.
      • Проведите стерильным одноразовым ватным тампоном или щеточкой для взятия мазков (для буккального или назального эпителия и т.д.) в носу или во рту объекта
      • Отрежьте участок, на котором собраны клетки и поместите его в микроцентрифужную пробирку, содержащую лизирующий буфер
      • Закройте пробирку, перемешайте на вортексе и инкубируйте при комнатной температуре 5 минут.
   4. Клеточная культура в монослое
      • Отделите культуральную среду
      • Добавьте 500 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME) на 1-5 х 10⁶ клеток.
      • Лизируйте клетки и гомогенизируйте образец пипетированием в течение некоторого времени
   5. Клеточная культура в суспензии
      • Осадите 1-5 х 10⁶ животных, растительных или дрожжевых клеток или 1 х 10⁷ бактериальных клеток. (В некоторых случаях для разрушения клеточной стенки дрожжевых и бактериальных клеток может потребоваться дополнительный ферментативный лизис или механическое воздействие)
      • Удалите супернатант и добавьте 500 мкл лизирующего буфера (с добавлением 2-ME).
      • Лизируйте образец повторяющимся пипетированием или перемешиванием на вортексе в течение 10 секунд.
2. Активация колонки (необязательно):
   • Поместите спин-колонку в 2 мл пробирку для образцов
   • Добавьте 100 µl Активационного буфера в спин-колонку
   • Центрифугируйте при 10 000 g в течение 30 секунд
   • Удалите отфильтровавшуюся жидкость
   • Немедленно переходите к следующему шагу
3. Загрузка колонок:
   • Добавьте 300 мкл (или 0.6 x объема клеточного лизата) Изопропанола к подготовленному лизату и перемешайте на вортексе.
   • Переместите смесь в спин-колонку
   • Центрифугируйте 30 секунд при 10 000 g
   • Удалите отфильтровавшуюся жидкость
4. Первичная отмывка:
   • Выделение из крови
     • Добавьте в колонку 700 µl отмывочного буфера для крови
     • Центрифугируйте 30 секунд при 10 000 g и удалите отфильтровавшуюся жидкость
   • Выделение из тканей, щеток и клеточных культур
     • Добавьте в колонку 700 µl первичного отмывочного буфера
     • Центрифугируйте 30 секунд при 10 000 g и удалите отфильтровавшуюся жидкость
5. Вторичная отмывка:
   • Добавьте в колонку 700 µl вторичного отмывочного буфера
   • Центрифугируйте 30 секунд при 10 000 g и удалите отфильтровавшуюся жидкость
   • Центрифугируйте снова 2 минуты при 10 000 g для удаления остатков этанола
6. Элюция РНК:
   • Поместите спин-колонку в чистую, свободную от ДНКаз/РНКаз микроцентрифужную пробирку.
   • Добавьте 40-50 µl элюционного буфера в центр мембраны колонки
   • Инкубируйте 1 минуту при комнатной температуре
   • Центрифугируйте 1 минуту при 10 000 g для извлечения ДНК в раствор
   • Храните РНК при -20 или -80 °C.

Удаление остаточной ДНК

Остаточная геномная ДНК может быть особенной проблемой при последующем RT-PCR или количественном определении низкокопийных транскриптов. Для полного удаления геномной ДНК из препарата РНК рекомендуется Jena Bioscience gDNA Removal Kit (Cat.-No. PP-219). Набор основан на термолабильной двуцепочечной ДНКазе (dsDNase), необратимо инактивирующейся при умеренных температурах.
Информация представлена исключительно в ознакомительных целях и ни при каких условиях не является публичной офертой